Vor der Bertholdsburg, durch einen tiefen Graben getrennt, liegt die Stadtkirche St. Johannis. Der 44 Meter hohe Kirchturm ist das höchste Bauwerk Schleusingens und weithin sichtbar.
Der ursprüngliche Bau der Kirche kann schon 1235 als Pfarrkirche angenommen werden. 1291 wurde durch Berthold Vl. von Henneberg hier ein Johanniterorden gegründet. 1307 wurde durch den Bischof von Würzburg der nahe gelegene Friedhof geweiht. 1308 brannte durch Blitzschlag der Glockenturm ab. Es begann der Wiederaufbau, der aber nur schleppend voran ging. 1498 endlich wurde ein Kirchenneubau geweiht.
Die heutige St. Johanniskirche besteht aus dem Chor, dem Kirchturm auf der Nordostseite, einem Treppentürmchen, der Ägidienkapelle im Süden und einem einschiffigen, rechteckigen Langhaus. Es ist ein schlichter Sandsteinbau. Eine neue Ausstattung, Altar, Kanzel und Orgel wurden 1629 geweiht. 1723 erfolgte dann der Neubau des Kirchenschiffes von Grund auf in Quadern. Die Gipsstuckdecke aus dieser Zeit ist nach 1880 ausgebrochen worden und durch eine flache Holzdecke ersetzt.